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Titre : | Mise au point dune technique de qPCR sur sang maternel pour la détermination pré-natale du RHD f |
Auteurs : | Anaïs Collay, Auteur ; Marie Deleers, Promoteur |
Type de document : | Travail de fin d'études |
Editeur : | Woluwe-Saint-Lambert : Haute École Léonard de Vinci, 2022 |
Langues: | Français |
Index. décimale : | TFE - Biologie médicale |
Mots-clés: | Érythroblastose du nouveau-né ; Immunoglobuline rh ; Test prénatal non invasif ; Génotypage RHD ftal ; Plasma maternel |
Résumé : |
La détermination du statut RHD du ftus est utile pour identifier les femmes RhD- qui auront besoin d'une prophylaxie par immunoglobuline humaine anti-D mais aussi pour détecter les ftus à risque de maladie hémolytique du ftus et du nouveau-né chez les femmes qui ont déjà développé un anticorps anti-RhD.
L'objectif de ce travail est de développer une technique de qPCR non invasive à partir de l'ADN ftal libre circulant (ADNflc) dans le plasma maternel, pour détecter si le ftus est RhD + ou -, chez une femme enceinte RhD-. En effet, l'ADNflc peut être libéré par les trophoblastes du placenta et se retrouver dans le plasma maternel. L'intérêt de cette technique consiste à être moins invasive que l'amniocentèse. Le phénotype RhD+ est dû à la présence du gène RHD à l'état homozygote ou hémizygote, l'allèle RHD*01 étant l'allèle de référence codant pour l'antigène D normal. Le phénotype RhD- dans la population caucasienne est principalement causé par la délétion homozygote du gène RHD. Chez les individus d'origine africaine, le génotype conduisant à ce phénotype est plus compliqué, il s'agit soit d'une délétion du gène RHD(RHD*01N.01), soit d'un allèle variant RHD*y, soit d'un allèle hybride RHD*D-CE(4-7)-D. Des amorces et des sondes ciblant les exons 4, 5, 7 et 10 du gène RHD ont été conçues afin d'identifier les différents allèles cités ci-dessus. Elles ont été testées sur de l'ADN génomique et ftal. Tout d'abord, une extraction de l'ADN a été réalisée. L'ADN génomique a été extrait d'échantillons venant dun tube EDTA d'individus dont le génotype était connu en utilisant une méthode manuelle avec un kit commercial (Quick-DNA Blood Miniprep Kit, Zymo Research). L'ADN ftal a été extrait du plasma maternel (tubes BCT Cell-Free DNA), en utilisant une méthode automatisée avec le système automatisé Vanadis Extract (Perkin Elmer). Ensuite, la qPCR a été réalisée (QuantStudio 5 Real-Time PCR System (ThermoFisher)). Un contrôle interne de l'extraction et de l'amplification a également été testé. Les amorces et la sonde ciblant l'exon 4 se sont révélées spécifiques de l'allèle RHD*y qui est fréquemment présent chez les individus d'origine africaine. Les amorces et les sondes ciblant l'exon 5 ont amplifié l'allèle RHD*01 mais aussi, de manière moins efficace, l'allèle RHD*y. Les amorces et les sondes ciblant l'exon 7 se sont révélées spécifiques des allèles RHD*01 et RHD*y. Les premières amorces et sondes ciblant l'exon 10 qui ont été testées ont amplifié les allèles RHD*y, RHD*01, RHD*D-CE(4-7)-D et malheureusement aussi RHD*01N.01. D'autres amorces et sondes ont été testées et ont amplifié les allèles RHD*y, RHD*01, RHD*D-CE(4-7)-D mais pas l'allèle RHD*01N.01. En conclusion, la méthode peut être utilisée pour détecter les allèles RHD*y, RHD*01, RHD*D-CE(4-7)-D et RHD*01N.01 mais la performance de la technique doit être testée sur un plus grand nombre d'échantillons. |
Accès : | Identifiez-vous avant d'accéder au document électronique |
Disponible en ligne : | Oui |
Lieu du stage : | CHU Brugmann (LHUB-ULB), Banque de sang |
Département : | Biologie médicale |
Documents numériques (1)
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