| Titre : | Rôle du motif DDVF de la protéine SPRED2 dans la régulation de la voie des MAPK et de RSK |
| Auteurs : | Anca Marian, Auteur ; Thomas Michiels, Promoteur |
| Type de document : | Travail de fin d'études |
| Editeur : | Woluwe-Saint-Lambert : Haute École Léonard de Vinci, 2023 |
| Langues: | Français |
| Index. décimale : | TFE - Biologie médicale |
| Mots-clés: | Protéine SPRED2 ; humain ; Rétrocontrôle physiologique ; Ribosomal protein S6 kinases ; 90-kDa ; Système de signalisation des MAP kinases |
| Résumé : |
La voie des MAPK est une voie intracellulaire qui permet à la cellule de répondre à un stimulus extracellulaire tel que la présence de facteur de croissance, le stress ou les hormones. L'activation de cette voie commence par la liaison d'un ligand à un récepteur tyrosine kinase tel que FGFR1. Suite à cette liaison, le récepteur s’active par autophosphorylation ce qui entraîne le recrutement et la phosphorylation de plusieurs protéines. Cette voie aboutit à l’activation de deux kinases : ERK et RSK qui régulent des
processus cellulaires clés tels que la prolifération, la croissance, la survie et la motilité cellulaire. En raison de ces fonctions importantes, cette voie doit être régulée. Cette régulation est partiellement effectuée par RSK qui phosphoryle différentes protéines comme SPRED2 afin d'inhiber la voie. Il a déjà été démontré que plusieurs pathogènes produisent des protéines possédant un motif DDVF qui leur permet d’interagir avec RSK et détourner cette kinase à leur profit. C'est pourquoi une recherche de protéines contenant un motif DDVF a été effectuée dans le protéome humain. Le motif DDVF a été trouvé dans de nombreuses protéines, dont SPRED2. L'interaction entre cette protéine et RSK a été démontrée dans une expérience précédente. Cependant, au cours de la recherche du motif DDVF dans le protéome humain, nous avons découvert que de nombreuses protéines contenant ce motif font partie de la voie MAPK. Cette observation conduit à l'hypothèse principale de ce projet : Le motif DDVF de ces protéines pourrait être impliqué dans le rétrocontrôle négatif et donc dans la régulation de la voie MAPK. Ce travail de fin d’études est centré sur le motif DDVF de la protéine SPRED2. Afin d'étudier l'effet du motif DDVF sur l'activation et la régulation de la voie MAPK, des cellules HeLa ont été transfectées avec SPRED2-DDVF (sauvage) ou SPRED2-DDVA (mutant). La voie des MAPK a été stimulée par du b-FGF, et les cellules ont été collectées et analysées par Western Blot. En détectant la quantité de phospho-RSK et phospho-ERK (forme active des enzymes), nous avons pu observer l'activation de cette voie.Les résultats montrent que le motif DDVF de SPRED2 interagit clairement avec RSK et maintient cette enzyme active probablement comme les protéines de pathogène contenant ce même motif. Un impact de SPRED2 sur le rétrocontrôle négatif a également été observé, mais cela était attendu car SPRED2 est connu pour être un inhibiteur de la voie des MAP kinases. Cependant, l'impact du motif DDVF de SPRED2 sur l'activation ou la régulation de la voie des MAPK n'est pas clair. Ce résultat incertain pourrait être dû à la quantité non physiologique de SPRED2 dans les cellules après transfection. C'est pourquoi nous avons décidé de créer des cellules SPRED2-KO (knock-out) et de réexprimer SPRED2-DDVF ou SPRED2-DDVA pour étudier l'impact du motif DDVF. Les cellules SPRED2-KO ont été créées par CRISPR/nCas9. Le mutant nickase de la Cas9 a été utilisée dans le but de minimiser les éventuels effets hors-cible. De nombreux clones ont été analysés par Western Blot mais aucun d’entre eux n’était complètement KO.Pour la réexpression de SPRED2-DDVF ou SPRED2-DDVA, des plasmides lentiviraux ont été construits par réaction LR Gateway et par restriction-ligation. Afin d'étudier l'impact du motif DDVF dans des conditions plus physiologiques, des cellules SPRED2-KO ou KD (knock-down) seront construites avec d’autres ARN guides et les plasmides lentiviraux codant pour SPRED2-DDVF ou SPRED2-DDVA y seront transfectés |
| Accès : | Identifiez-vous avant d'accéder au document électronique |
| Disponible en ligne : | Oui |
| Lieu du stage : | Laboratoire de virologie moléculaire de l’Institut de Duve, UCL |
| Département du TFE : | Biologie médicale |
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