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Titre : | Génotypage et biotinylation par marquage de proximité des partenaires de la protéine TSPO de plante |
Auteurs : | Ines DJABALLAH, Auteur ; Henri Batoko, Promoteur |
Type de document : | Travail de fin d'études |
Editeur : | Woluwe-Saint-Lambert : Haute École Léonard de Vinci, 2021 |
Langues: | Français |
Index. décimale : | TFE - Biologie médicale |
Mots-clés: | AtTSPO ; régulation de l'expression génique ; plantes génétiquement modifiées ; marquage de proximité ; TurboID ; clonage |
Résumé : | Ce travail de fin détudes a été mené dans le cadre de la recherche en cours du LIBST-FYMO consacrée à la protéine TSPO végétale. Les TSPO végétales sont des protéines transmembranaires exprimées de manière transitoire en réponse à des stress abiotiques, y compris un stress osmotique. Dans le prolongement des découvertes précédentes, le laboratoire hôte a généré des lignées de plantes transgéniques Arabidopsis exprimant l'Arabidopsis thaliana TSPO (AtTSPO) pilotée par un promoteur inductible spécifique du type cellulaire. Notre premier objectif était de génotyper ces lignées afin d'identifier celles ayant le transgène dans leur ADN génomique. À cette fin, nous avons effectué une extraction d'ADN génomique à partir de tissus végétaux et utilisé la PCR pour détecter la présence de la séquence d'intérêt. Ensuite, nous avons utilisé les lignées transgéniques identifiées pour vérifier l'expression du transgène au niveau des protéines. Dans une expérience au cours du temps, les tissus végétaux ont été incubés avec l'inducteur 17-bêta-estradiol et l'extrait de protéines totales préparé à des moments définis a été analysé par Western blot. Nous avons montré que les lignées génotypées positivement expriment AtTSPO après traitement à linducteur, et l'expression optimale a été observée environ 12 heures après induction. Le deuxième objectif était de mettre au point une construction génétique basée sur la biotine ligase TurboID récemment décrite, permettant la biotinylation in vivo de protéines qui interagissent avec la TSPO lors de sa dégradation. La construction génétique conçue a été préparée en utilisant les techniques d'assemblage Golden Gate et de clonage Gateway. Pour valider cette construction, nous avons utilisé l'expression transitoire médiée par Agrobacterium dans les feuilles de tabac. Les protéines totales ont été extraites à partir des tissus transfectés, et la fraction enrichie en protéines biotinylées a été obtenue par purification par affinité sur des billes de streptavidine. Les analyses par Western blot des diverses fractions suggèrent que la construction conçue peut facilement générer une biotinylation des protéines in vivo. Cette construction servira de fil conducteur pour les prochaines expériences du laboratoire. |
Accès : | Identifiez-vous avant d'accéder au document électronique |
Disponible en ligne : | Oui |
Lieu du stage : | UCL - LIBST - FYMO |
Département : | Biologie médicale |
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