| Titre : | Caractérisation biochimique de l’activité des L,D-transpeptidases A/B/C d’Escherichia coli |
| Auteurs : | Marie Dechamps, Auteur ; Patrice Soumillion, Promoteur |
| Type de document : | Travail de fin d'études |
| Editeur : | Bruxelles : Institut Paul Lambin, 2021 |
| Langues: | Français |
| Index. décimale : | TFE - Chimie |
| Mots-clés: | Caractérisation ; L ; D-transpeptidase ; E. coli ; mutation ; PCR ; gel SDS-Page ; Western-Blot ; colonne de Nickel ; spectroscopie de masse |
| Résumé : |
Dans la lutte contre la résistance des antibiotiques par les bactéries, l’enveloppe bactérienne est une cible de choix pour développer de nouveaux antibiotiques. Il faut donc d’abord la comprendre pour ensuite pouvoir y développer de nouveaux antibiotiques.
La synthèse de l’enveloppe des bactéries Gram négatives fait notamment intervenir des réactions de transpeptidations entre les muropeptides du peptidoglycane et des protéines ancrées dans la membrane externe comme la lipoprotéine de Braun. Les L,D-transpeptidases A, B et C d’Escherichia coli sont en charge de ces réactions. Elles catalysent la formation d’un lien isopeptidique formé entre la lysine C-terminale de la lipoprotéine de Braun et le résidu méso-diaminopimélate en troisième position sur le muropeptide. Dans la littérature, il est généralement accepté que la réaction a lieu au départ d’un muropeptide à quatre résidus (tetrapeptide) mais cela n’a jamais été démontré. Des observations du laboratoire d’accueil suggèrent cependant que ces enzymes pourraient préférer des substrats pentapeptidiques. Les L,D-transpeptidases A, B et C ont déjà été surexprimées et purifiées lors d’une précédente recherche mais les protéines migraient anormalement lors de l’analyse par gel SDS-PAGE. Elles migraient à 38kDa plutôt qu’à leur masse théorique de 33kDa. Ceci suggérait une possible modification du site actif des enzymes. L’objectif de ce travail est donc dans un premier temps de créer des mutants inactifs des trois L,D-transpeptidases et d’analyser leurs migrations en électrophorèse et, dans un second temps, de tenter d’identifier le substrat des L,D-transpeptidases A, B et C d’Escherichia coli. Pour ce faire, chaque gène codant pour les L,D-transpeptidases A, B et C a été muté par PCR, puis exprimé et les protéines recombinantes ont été analysées par western-blot. Cela a permis de prouver que la migration anormale des L,D-transpeptidases A, B et C n’est pas due à une modification du site actif. Une purification des protéines au départ d’extraits périplasmiques a été tentée mais n’a pas abouti car les L,D-transpeptidases précipitent lorsqu’elles sont congelées. Des essais de réactions de transpeptidation au départ d’un extrait périplasmique contenant la L,D-transpeptidase B surexprimée et non congelée ont été réalisés par ajout de peptides donneurs et accepteurs. L’analyse par spectrométrie de masse montre que la réaction de transpeptidation a eu lieu avec un substrat tétrapeptidique et non avec le substrat pentapeptidique comme attendu au départ. |
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| Disponible en ligne : | Oui |
| Lieu du stage : | LLN/UCL/Mr |
| Département du TFE : | Chimie |
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